サマリウムコバルト (SmCO5) を使用した磁気曝露により、ヒト臍帯間葉系幹細胞 (hUC) の増殖と幹細胞性が増加しました。

Scientific Reports volume 12、記事番号: 8904 (2022) この記事を引用

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5 オルトメトリック

メトリクスの詳細

人体に対する磁場 (MF) 曝露の潜在的な危険性に関する広範な報告にもかかわらず、最適な曝露での幹細胞の増殖特性の改善についても同時に報告されています。ただし、間葉系幹細胞 (MSC) に対する影響は不明のままです。したがって、我々は、サマリウムコバルト（SmCO5）を使用して、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（hUC-MSC）に対する誘導静的MF（SMF）の影響を調査することを目的としました。継代 3 で、hUC-MSC (1 × 104) を直接曝露 (DE) により 21.6 mT SMF に曝露したところ、間接的曝露と比較して集団倍加時間が最も短く、増殖速度論アッセイにおいて有意に高い細胞数 (p < 0.05) が示されました。露出とネガティブコントロール。 DE グループは、NC グループと比較して S 期 (55.18 ± 1.38%) および G2/M 期 (21.75 ± 1.38%) が増加し、細胞周期に移行しました [S 期 (13.54 ± 2.73%)。 G2/M 期 (8.36 ± 0.28%)]。免疫表現型に有意な変化は観察されませんでしたが、DE グループでは多能性関連マーカー (OCT4、SOX2、NANOG、および REX1) の発現上昇が示されました。これらの結果は、MF が MSC の増殖を誘導する可能性があることを示唆しており、これは hUC-MSC の幹細胞性を損なうことなく臨床治療や研究のための幹細胞の増殖を促進する有望なアプローチであると考えられます。

近年、ヒト成人幹細胞の生物学に関する理解に大きな進歩が見られ、臨床効果の向上が報告されたことを受けて治療用途が急増していることが反映されています。細胞ベースの治療 1,2、バイオ人工臓器 3,4 の開発、および迅速な組織再生 5,6,7 による創傷組織修復から、さまざまな種類の癌の治療 8,9 に至るまで、幹細胞移植によるヒト成人幹細胞の採用は、高い治療効果にもかかわらず、宿主拒絶反応や副作用のリスクが最小限に抑えられているため、広く人気を博しました。

骨髄 (BM) で生成される間葉系幹細胞 (MSC) は、ヒト MSC の成体ソース組織として最も一般的かつ最も長く利用されていると考えられています。「成人」MSC のもう 1 つの成人源は、出生時に廃棄されることが多い臍帯組織および胎盤です 10。それらは、高い自己再生特性と優れた潜在的な差別化能力を備えています11。 MSC は、骨、脂肪、軟骨、腱、骨格筋などの中胚葉系統の細胞を生じさせる可能性があることが示されています 12、13、14。 MSC は、膵島細胞 15、心筋 16、肝細胞 17、神経細胞 18 などのさまざまな非中胚葉系統組織にも分化する可能性があることが、いくつかの報告で示されています。他の組織特異的な成体幹細胞と比較して、MSC は損傷部位への標的化されたホーミング能力と、多くの異なる間葉系および実質細胞型に分化する能力により、好ましい治療薬です 19。 MSC はまた、組織再生の誘導、移植耐性、自己免疫の制御に関与すると考えられる血管新生促進性、抗炎症性、抗アポトーシス性のサイトカイン/因子を大量に分泌するという点で、独特の修復特性と免疫抑制特性を持っています 20,21。 MSC は宿主の免疫応答を回避できる免疫特権特性に起因するため、MSC の介入を伴う血管内療法は依然として低リスクの臨床処置として残っています。宿主免疫応答に関与する他の素因に加えてこの因子が、治療の最終的な臨床転帰を導く上で主要な役割を果たす可能性があるため、MSCの最適な投与量と送達方法を評価するためにさらなる研究が行われる可能性がある。

しかし、治療可能性のあるMSCは、研究および治療目的でMSCの増殖と継続的増殖を容易に刺激するために必要な最適条件を決定することによってのみ利用できます22、23、24、25。臍帯組織は新たに単離された細胞の供給源が限られており、研究ではヒト臍帯 MSC (hUC-MSC) が骨髄または脂肪組織由来の MSC と比較してより高い増殖能力を示すことが示唆されています 26,27 が、その後の細胞の増殖が必要です。幹性や分化能力を変えることなく、大規模な in vitro 増殖が可能です。したがって、臨床上の需要を満たすために、hUC-MSC の大幅な増殖を促進できる最適な培養条件を決定することが課題となります。

一般に、人間や他の生物は、地球の無害な MF や、永久磁石として知られる磁性材料から得られる他の無害な MF の発生源に自然にさらされています。 MF の有害な形態と無害な形態の二分法を理解する鍵は、その発生源に基づいて MF を分類することにあります。 MF には基本的に 2 つのタイプ、つまり内生フィールドと外生フィールドがあります。内因性フィールドは、体内で生成される MF です。このタイプの MF は、心臓 28、29、30、脳 31、32、目 33 などのさまざまな電気的に興奮可能な器官で発生します。研究では、MF が筋骨格系のパフォーマンスに影響を与えることも示されています 34。一方、外因性磁場は体外のソースによって生成される MF であり、地球の地磁気場 (例: サマリウムコバルト (SmCo5) またはネオジムフェルムボロン (NdFeB)) などの自然外因性磁場、または人工外因性磁場 (人間の磁場) に分類できます。 -製) 電力線、変圧器、電化製品、無線送信機、医療機器などの MF 35,36。人工外因性 MF は多くの研究者によって特定されており、長期または頻繁に曝露されると人間や他の生物に深刻な有害および危険な影響を与える MF の形態です。 MF はいくつかの医学的合併症と関連しているため、ヒトが MF に頻繁に曝露されると、深刻な健康上の懸念が生じています。いくつかの種類の癌37、腫瘍38、神経膠芽腫39,40および白血病41はMF曝露と関連している。人間は、職場、家庭、地下鉄、その他の公共の場所での日常活動により、有害な形態の MF に曝露されるリスクに常にさらされているため、研究者は MF の有害な影響を調査することに重点を置き、そのための開発を行っています。 Zanella によって報告されているように、これらの毎日の曝露を模倣する人工外因性 MF の生成と操作のための技術。興味深いことに、ある研究では、一定の短期間の最適なMF曝露は、驚くべきことに細胞増殖を大幅に促進する可能性があると結論付けています。それ以来、多くの研究が実施され、骨折の治癒促進や骨粗鬆症の停止など、MF 曝露の好ましい効果が報告されています 42,43,44。したがって、私たちの研究は、SmCo5を使用して、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞の増殖傾向に対する誘導静磁場（SMF）の潜在的な影響を調査することを目的としました。 NdFeB 磁石に次ぐ磁石強度を持つ SmCo5 は、強力な永久モーメント磁化を有し、減磁の影響に対して安定であるため、この実験では磁気源として選択されました。また、比較的高温の実験にも適しており、錆びにくいため塗装やシーリングなどの表面処理が不要です45,46。この研究では、SmCo5 の制御可能なモデルが MF の発生源として設計され、比較的短時間でこれらの長期的な影響をシミュレーションできます。本研究の目的は、hUC-MSC の増殖、増殖速度および遺伝子発現に対する SMF SmCo5 の曝露の影響を調査することにより、最適な培養系を見つけることであり、その目的は、増殖能を高めるための代替技術として MF 曝露を特定することである。 MSC の特性を変えることなく、MSC の容量を向上させることができます。これに向けて、我々は将来の SMF SmCo5 in vitro 実験の前に重要な基礎を提供します。

細胞形態の観察は、図 1 に示すように、0 日目から 10 日目まで培養した継代 3 の hUC-MSC で記録されました。両方の試験グループ (DE および IE) と対照 (NC) グループの接着細胞は、 2日目に細胞が細長い線維芽細胞様の紡錘形を維持していることが観察され、これは健康なMSCの特徴です。紡錘形の形態は 10 日目まで両グループで保持されていましたが、100% コンフルエンスに達するまでに必要な時間には顕著な差がありました。 DE グループは培養 8 日目に 100% コンフルエンスに達しましたが、IE および NC グループの細胞コンフルエンスは約 80% でした。しかしながら、10日目まで培養した後、IE群ではコンフルエンスは変化しなかったが、NC群では顕著に改善した(図1)。

hUC-MSCの形態学的観察。 DE、IE、および NC グループにおける継代 3 の hUC-MSC の細胞形態の観察。すべての細胞は特徴的なMSC線維芽細胞様の紡錘形を示し、DEグループは8日目に100%のコンフルエンスに達しましたが、IEグループは10日目以降でもコンフルエンスが最も低かったです。NCグループは10日目に100%のコンフルエンスに達しました。すべての顕微鏡写真はCKX41 倒立顕微鏡 (オリンパス、日本) を使用して倍率 100 倍で撮影。

増殖動態から得られた結果は、テストグループとコントロールグループの細胞が、誘導期で始まり、指数関数的増殖期が続き、定常期で終了する同様の増殖パターンを示したことが示されました（図2a）。 DE、IE、および NC グループでは、遅滞期は 4 日目まで続き、指数関数期は 10 日目にピークに達しましたが、NC グループと比較して DE グループでは細胞数が大幅に増加しました (3.13 × 104 ± 0.11)。 2.66 × 104 ± 0.21 セル)。細胞数の有意な減少が、NC と比較して IE グループ (1.47 × 104 ± 0.15 細胞) で観察されました。しかし、対数期がピークに達する 10 日目では、DE 群と NC 群の間に有意差はありませんでしたが、IE 群では細胞数の有意な低下が観察されました (つまり、IE [9.42 × 104 ± 0.56 細胞] 対 NC [ 12.4 × 104 ± 0.55 セル]）を図 2b に示します。また、対数期のピークに達すると、両方のテストグループと対照の細胞が、増殖の定常期で予想されるプラトー期ではなく、増殖が急激に低下したことも観察されました（図2a）。動力学。継代 1 から継代 6 までの hUC-MSC に対して行われた集団倍加時間 (PDT) 分析では、細胞が継代 4 まで増殖するにつれて PDT が減少し、その後継代 6 までプラトーになりました。興味深いことに、 IE グループの細胞数は、継代 1 ～ 6 を通じて DE および NC グループの細胞と比べて高く、継代 3 で記録された NC と比較して IE グループでは統計的に有意な増加 (p < 0.05) がありました。 DEグループの細胞とNCグループの細胞のPDT（図2c）。

死細胞の直接的および間接的なMF曝露の影響を示すhUC-MSCの増殖動態。（ a ）誘導期で始まり、4〜10日目に指数関数的増殖期が続き、定常期が終了する同様の増殖パターンが、直接群と対照群の細胞で示されました。 (b) DE、IE、および NC グループ間の 4 日目 (遅滞期の期間) と 10 日目 (指数関数期ピーク) の細胞数の比較。* は対照 (NC) と比較して統計的に有意な増加を示し、# は統計的増加を示します。対照（NC）と比較して有意な減少（p < 0.05）。（ c ）継代1から継代6までの、曝露されたMF（DEおよびIE）および対照（NC）hUC-MSCの集団倍加時間（PDT）。細胞が継代4まで増殖するにつれて、PDTは減少し、その後、 6パッセージまではプラトー。 * は、対照 (NC) と比較して細胞数が統計的に有意に増加していることを示します。しかし、DE グループの細胞の PDT と NC グループの細胞の PDT の間には有意差はありませんでした (p < 0.05)。

MF への曝露後の細胞表面マーカーの発現を評価することによって行われた hUC-MSC の特性評価では、CD105 を除いて、MF は 72 時間の培養インキュベーション後でも細胞の免疫表現型の完全性を完全には変化させないことが示されました。その結果、3 つのグループすべての細胞が免疫学的および血液学的マーカーに対して陰性発現を示したことが明らかになりました。ＭＳＣマーカーの陽性発現と結合したＣＤ１４、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＨＬＡＤＲ、ＤＰ、ＤＱｉｉ． CD29、CD73、CD105、および HLA-ABC (図 3a ～ e) CD105 を除き、抗体は Benton Dickinson から購入しました。CD105 は R&D system から購入しました (表 1)。さらに、DE 群と IE 群の間では、NC 群と比較して細胞表面マーカーの発現レベルに有意差はありませんでした。図3aに示すように、DEグループの細胞の90％以上がCD29、CD73、およびHLA-ABCについて陽性発現を示し、CD105について陽性である割合はより低い（37.4％）。同様の傾向がIEグループでも観察され（図3b）、HLA-ABCとCD105のそれぞれ84.2％と47.9％の陽性発現を除いて、CD29とCD73について90％以上の陽性発現を示しました。最後に、NC グループの細胞の 90% 以上 (図 3c) が、パーセンテージが 62.6% である CD105 を除き、CD29、CD73、および HLA-ABC を発現しています。 3 つのグループすべての細胞の CD14、CD80、CD86 および HLA-DR の発現は 1% 未満でした。 hUC-MSCはSMFに曝露された後でもMSC発現に関して陽性であるため、SMF SmCo5はMF環境で72時間培養した後でもhUC-MSCの免疫表現型の変化または有意な効果には寄与しないと結論付けることができます。 CD105の発現は大幅に減少しましたが、MFは治療後のMSCの表面表現型に有意な変化を引き起こしませんでした（図3d、e）。

(a) 直接曝露された (DE) hUC-MSC 上のコントロールパネルと細胞表面マーカーの発現。細胞は、CD29、CD73、およびHLA-ABCについて90%を超える陽性発現を示したが、CD105については陽性率が低く、わずか37.4%であったが、CD14、CD80、CD86およびHLA-DRについては1%未満の発現が観察された。 (b): 間接的に曝露された (IE) hUC-MSC 上のコントロールパネルおよび細胞表面マーカーの発現。細胞は、CD29、CD73、およびHLA-ABCについて90%を超える陽性発現を示したが、CD105については陽性率が低く、わずか47.9%であったが、CD14、CD80、CD86およびHLA-DRについては1%未満の発現が観察された。 (c) コントロールパネルおよびコントロール (NC) hUC-MSC 上の細胞表面マーカーの発現。細胞は、CD29、CD73、およびHLA-ABCについて90%を超える陽性発現を示したが、CD105については陽性率が低く、わずか62.6%であったが、CD14、CD80、CD86およびHLA-DRについては1%未満の発現が観察された。 (d): 結果は、細胞表面マーカータンパク質 CD29、CD73、および HLA-ABC の発現が NC と比較して DE と IE の間で類似していることを示していますが、一方、エンドグリン (CD105) は、NC と比較して DE および IE グループで大幅に減少しています。グループ。 * ネガティブコントロールと比較した統計的に有意なグループを示します。（ e ）結果は、MSCにおける血液学的および免疫学的マーカーの発現パターンが、グループ間に有意差がなく、同様であることを示しています。 (f) hUC-MSC の骨細胞への分化。 MSC をコンフルエントになるまで培養し、適切な培地を使用して合計 21 日間刺激して骨細胞に分化させました。細胞化学的染色実験によると、両方の試験グループ (DE、IE) で処理した hUC-MSC は骨形成細胞に成長することができました。アリザリンレッドSで染色したカルシウム沈着により、骨形成分化が明らかになりました。すべての顕微鏡写真は、CKX41 倒立顕微鏡 (オリンパス、日本) を使用して倍率 100 倍で撮影されました。

分化研究の予備調査では、DE および IE グループの hUC-MSC をコンフルエンスまで培養し、骨形成分化に供しました。市販のMSC骨形成分化アッセイキットを使用して、細胞を骨形成誘導培地中で21日間インキュベートした。両方の試験グループの hUC-MSC は骨形成分化を起こすことができ、細胞化学的染色によって視覚化された骨形成マーカーを発現しました。細胞を骨形成誘導培地で増殖させ、アリザリンレッドSで染色すると、骨形成分化の兆候としてのカルシウム沈着により、鮮やかな赤色の染色が明らかになりました（図3f））。

SMF SmCo5 は指数関数的増殖期での増殖を増強できるため、細胞周期を介して hUC-MSC の DNA 含有量を調べるためにさらなる実験を実施しました。図4aに示すように、我々の調査結果は、18時間後、MFで処理した細胞の数が多いほど、IEと比較してS期およびG2 / M期の後に観察されるより高いPIシグナル強度（それぞれ55.18％および21.75％）を示したことを示しました。および NC グループは、DE グループが S および G2/M 期に移行したことを示唆しています。最後に、21.6 mT の MF 強度や hUC-MSC への 18 ～ 30 時間の範囲の MF 曝露時間などの要因は、NC の細胞周期において重要な役割を果たしていないように見えました。したがって、この発見は、DE SMF 処理 hUC-MSC が、hUC-MSC が細胞周期 (早ければ 18 時間) に進むことを可能にする最適な条件であることを示唆しています。 18、24、および30時間の比較を図4b〜dに示します。

（ a ）18、24、および30時間の培養後の、MFに曝露されたhUC-MSC（DEおよびIE）および対照（NC）hUC-MSCの細胞周期分析を示すDNA分布。 DE の細胞は、G0/G1 期が著しく減少し、S 期と G2/M 期が増加したため、細胞周期に最初に進行しました (早ければ 18 時間)。この傾向はIEグループが24時間で追従したが、NCグループは30時間まで遅れた。 DE、IE、および NC グループの細胞周期相間のグラフによる比較。（ b ）写真は、18時間培養後のNCグループと比較してDEグループのG0 / G1期の減少とSおよびG2 / M期の増加を示しています。 (c) 24 時間の培養後の NC グループと比較して IE グループでは G0/G1 期が減少し、S 期および G2/M 期が増加していることを示します。一方、(d) は細胞周期期に有意差がないことを示しています。暴露グループと対照グループ。 * はコントロール (NC) と比較して細胞のパーセンテージが統計的に有意に増加していることを示し、# はコントロール (NC) と比較して細胞のパーセンテージが統計的に有意に減少していることを示します (p < 0.05)。

逆転写ポリメラーゼ反応 (RT-PCR) 産物のアガロースゲル電気泳動を実行して、誘導性幹性マーカーを表し、主に hUC-MSC の未分化細胞で発現される OCT4、SOX2、NANOG、および REX-1 遺伝子の発現を測定しました。全体として、処理サンプル（DE）は、対照（IEおよびNC）と比較して、これらの遺伝子のより高い発現を示しました（図5a）。図５ｂから、ＤＥグループは、ＩＥと比較して、ＮＡＮＯＧ発現の有意な増加（２．７３倍）をもたらしたことが示された。 DE群とIE群の間でOCT4、SOX2およびREX1の発現に有意差は観察されなかったが、DE群へのMF曝露はIE群と比較してOCT4の発現がわずかに増加したように思われた。これらの結果は、MF への曝露はこれらのマーカー遺伝子の発現を低下させず、代わりに hUC-MSC の幹性特性を維持できる可能性があることを示しました (補足ファイル)。

MF に曝露された hUC-MSC における多能性関連マーカー (OCT4、SOX2、NANOG、および REX-1) の遺伝子発現。 (a) 主に未分化MSCで発現されるマーカーの発現強度を決定するために実行されたアガロースゲル電気泳動上のRT-PCR産物。 (b) DE グループと IE グループの両方における OCT4 の上方制御を示す倍率変化。IE グループと比較して DE グループの発現レベルが高くなります。 SOX2 遺伝子は DE 群と IE 群で有意に下方制御されていましたが、DE では NANOG が IE 群と比較して有意に上方制御されていました (2.73 倍の変化)。

この研究で観察された結果は、hUC-MSC の in vitro 増殖の増強における MF の可能性を示しています。 MF の効果は、hUC-MSC の形態学的特性に対して初めて観察されました。調査の結果、DE、IE、および対照 (NC) グループ間で目に見える形態学的差異は観察されませんでしたが、合流に達する速度には顕著な改善が見られました。さらに、MF処理細胞は、健康なhUC-MSC（線維芽細胞様および紡錘状）の外観および形態を維持しているため、未処理細胞（NC）と同様の形態を示しました。これは、によって報告された研究と一致しています。 Marędziak et al.47、Du et al.48。したがって、これは、MF への直接曝露が、正常な形態構造を維持しながら伝播速度を増加させる強力な方法を提供する可能性があることを示唆しています。成長速度論の時間分析の肯定的な結果は、形態学的観察からなされた推論をさらに裏付けます。 DE 細胞は、指数関数期が開始した IE および NC と比較して、4 日目に高い細胞数を示しました。これは、MF 曝露が hUC-MSC の増殖動態を著しく改善し、したがってインビトロ増殖をタイムリーに促進することを示唆しています。この側面に関する私たちの観察は、他の 3 つの研究とは対照的でした。まず、Wiskirchen ら 49 は、増殖動態は MF への曝露によって変化せず、0.2、1.0、および 1.5 T の静磁場 (SMF) への繰り返し曝露はヒト胎児肺線維芽細胞 (HFLF) 細胞の増殖に影響を及ぼさないことを明らかにしました。 21日後。同様に、対照的な所見がMiyakoshi50によって報告されており、細胞をMFに曝露した後でも増殖速度に変化はなかった。第三に、Sun らは、指数関数的増殖期における骨髄間葉系幹細胞 (BMMSC) の動態解析がパルス電磁場 (PEMF) によって大きな影響を受けないことを示しました 43。彼らの発見とは対照的に、私たちの研究は成長動力学を変えることに成功しました。これは主に磁気曝露の方法と磁場曝露に使用される細胞源によるものと思われます。前述の観察に加えて、集団倍加時間により、試験群と対照群の両方で継代数の増加が減少しました。しかし、IE および NC グループと比較して、DE では倍加時間が短いことが観察されました。この観察は、Marędziak et al.51 の観察と一致しており、MF 条件の存在下で培養し、最短の PDT を掛け合わせたヒト脂肪由来間葉系間質幹細胞 (hASC) で最も高い増殖速度が観察されたと彼らは報告しています。対照的に、Sadri ら 52 は、hUC-MSC を 18 mT の SMF で処理したことを報告し、SMF が対照群と比較して PDT を長くすることを発見しました。ここで、我々は、21.6 mT SMF での hUC-MSC への MF の直接曝露が、最短の PDT で細胞増殖を増加させる最適な条件であることを示すことに成功しました。

MFへの曝露時のhUC-MScsの特徴付けは、細胞表面マーカーを分析することによってさらに行われ、DEおよびIEグループのCDマーカーが対照NCグループと比較して変わらないことが実証された。その結果、MFに曝露された環境で72時間培養した後でも、細胞は間葉系幹細胞様の表現型を示すことが示されました。 MSC は、その形態、生理機能、および表面抗原の発現の点で、不均一な細胞集団を構成しています。これまで、MSC に関して特定され、一般化された単一の特異的な細胞表面マーカーはありません。この研究では、フローサイトメトリーを使用して単離された hUC-MSC が造血幹細胞およびその前駆細胞からの汚染がなく均質であることを示しました。これは、陽性マーカー CD29、CD73、CD105 および HLA-ABC を表す免疫蛍光実験データ、および培養物中の陰性マーカー CD14 および HLA-DR および共刺激マーカー CD80、CD86 の発現欠如に対して確認されました。しかしながら、CD105 の発現レベルが暴露グループ、つまり DE および IE で大幅に低下したことに注意することが重要です。 DEおよびIEにおけるCD105の発現がNCと比較して減少していることは、それらの細胞運命が変化する可能性があることを示唆している。観察された減少が生物学的機能の抑制または増強と関連しているかどうかについては、さらなる調査が必要です。 CD105 を除けば、曝露群と対照群の間で細胞表面マーカーの発現レベルに有意差はありませんでした。 Sun ら 43 も同様の結果を得ており、MF 曝露は観察された表面表現型形態および BM-MSC の多系統分化能に有意な影響を及ぼさないと報告しています。 hUC-MSCはMFに曝露された後でもMSC発現（表面接着および細胞表面発現）に関して陽性であったため、MFはたとえMFによる有意な効果または免疫表現型の変化には寄与していないと結論付けることができる。 MF環境で72時間培養した後。

骨形成誘導培地で培養すると、培養物で生成された hUC-MSC は細胞化学的染色に基づいて骨細胞に分化しました。具体的には、MSC の生来の線維芽細胞様の形態は、誘導された骨形成中に立方体様の形状に変化しました。これらの細胞をアリザリンレッドで染色すると、細胞凝集と結節形成により赤レンガ色に見えました。染色色素の特定の領域はより濃くなっているように見え、一般的な骨形成の指標であるカルシウムの沈着であると考えられています。現在の研究の結果は、53、54、55 によって行われた研究と類似しています。ただし、この観察を徹底的に検証するには、骨形成のさらなる特徴付けを実行する必要があります。たとえば、これらの細胞のカルシウム含有量は比色アッセイによってさらに評価でき、RT-qPCR を利用して骨細胞マーカーの存在を確認できます。さらに、ウェスタンブロット分析では、骨形成に関連するタンパク質の存在を評価できます。ここでの我々の予備的な発見は、SMF SmCo5 が hUC-MSC の分化多能性、特に骨形成能に影響を与えないという概念を裏付けています。

MTT や細胞周期などの技術を使用した増殖アッセイでは、MF51、52、56 への曝露後に MSC の増殖が増加することが示されています。我々の結果は、DEグループの細胞はIEおよびNCグループと比較して、培養18時間という早い時点で細胞周期に関与することを示しました。時間の経過とともに、hUC-MSC は細胞老化を経験する可能性があり、より多くの細胞が G0/G1 期で停止します 57。細胞の老化はテロメラーゼ活性とテロメアの長さに密接に関係しています。テロメア長とテロメラーゼ活性は存在研究では測定されなかったが、細胞周期によって示される細胞周期進行の促進とアポトーシス活性の低下は間接的にテロメラーゼ活性を表す可能性がある。これは、強化されたMFがhUC-MSCの生存を誘導する可能性があること、またはMFが6〜48時間の細胞周期機構の抗アポトーシス剤として作用することを示唆している。細胞はおそらく休止状態を抜けて増殖を続ける可能性があります。したがって、老化プロセスは MF 露光によって防止される可能性があります。これを確認するには、カスパーゼアッセイなどのアポトーシス活性の測定を実施してさらに調査する必要があります。得られた結果は、DE グループで観察されたように、MF が検出された S 期および G2/M 期の細胞数を増加させることを示しました。

我々の RT-PCR 遺伝子発現分析により、継代 3 で NANOG 発現が IE と比較して DE で 2.73 倍増加したことが明らかになりました。これは、無線電気非対称コンベヤー (REAC) への曝露により 30この結果、幹細胞のDNA修復と自己複製において中心的な役割を果たすBmi1発現の上方制御が誘導されました。そのため、研究における MF は、REAC で観察されたように NANOG の増加を通じて細胞増殖を促進する可能性があります。 SOX-2 遺伝子の発現低下は、IE および NC と比較して DE 処理細胞においてより分化した細胞亜集団が形成されていることを示唆しています。この観察は、細胞の運命が何らかの生物学的現象を通じて実際に SMF によって影響を受けているという事実を正当化しており、さらなる研究が必要です。

本研究により、21.6 mT 強度の MF が、免疫表現型の完全性に影響を与えることなく、in vitro での増殖を刺激し、hUC-MSC の増殖を改善できることが明らかになりました。しかし、この優れた能力は、グローバル遺伝子評価および計算生物学ツールを使用して、主要なシグナル伝達経路に対するMF曝露の影響を分析することによってさらに探求することができます。現在の研究は、MSC の拡大における MF 曝露の基本的な可能性を発見することに向けられています。 OCT4、SOX2、REX-1 などの他の関連多能性マーカーの中で NANOG の遺伝子発現の増加は、潜在的な有害事象を示している可能性があります。以前の文献における NANOG と OCT4 のそのような共発現は、いくつかの悪性腫瘍の予後不良に反映されていたからです。肺がん、神経膠腫、腎細胞がんが含まれます59、60、61、62。したがって、その安全性についてより具体的な結論を得るために、この問題をより深く掘り下げるために別の研究が行われる予定です。さらなる調査には、さまざまな遺伝学およびメタボロミクス研究、癌幹細胞の幹細胞性および増殖を伴うMF曝露の調査、および癌発生への影響も含まれる。さらに、本研究で得られた重要な観察は、研究全体にわたる細胞IEグループの結果から明らかなように、hUC-MSCに対するMFの間接曝露のパフォーマンスが低いことである。 IE グループは技術的対照として導入されましたが、MSC を間接的に MF に曝露することで望ましくない影響が生じる可能性があることが示されました。ただし、将来の研究では、MSC の生物学的特性に対する磁気源の距離を考慮することが推奨されます。

この研究では、サマリウムとコバルトの合金で作られた、大きな永久磁化を実現する希土類磁石であるサマリウムコバルトが利用されました。磁気コンポーネントは 2 つのサマリウムコバルト磁石シリンダー (SmCo5 または SmCo シリーズ 1:5) で構成されていました。各磁石シリンダーは厚さ 4 cm、直径 9.5 cm で、剥離を避け、表面をより強靱にするためにニッケルでコーティングされていました。 SmCo5 磁石シリンダーは、N 極と S 極が向かい合うように調整可能なポジショナーを使用して、CO2 インキュベーター (Galaxy S.、米国) 内に設置されました。 SmCo5 磁石は異方性であるため、MF は一方向にのみ発生しました。図6aは、永久磁石の表面からのMF強度の概略分布を示しています。最高の MF 強度は 21.6 mT で、ガウスメーター (DC Gaussmeter Model GM 1-ST、Type ALPHALAB Inc、USA) を使用して測定および記録されました。この測定は、MF が完全に行われる永久磁石間の中央の細胞培養物の上に置きました。均一です（図6b）。インキュベーターには 3 つのコンパートメント、つまり上部、中間、下部のコンパートメントがあり、SmCo5 磁石は下部のコンパートメントに保持されます。

©はMFが最も均一で激しいところです。 (b) 直接曝露 (DE) グループと間接曝露 (IE) グループの細胞がインキュベーター内の異なる場所にどのように配置されたかを示すセットアップ。 DE グループと IE グループは同じインキュベーター内にあり、ネガティブコントロール (NC) グループは別のインキュベーター内にあります。

(a) 上の模式図は、一対の希土類磁石間の MF 線の分布を示しています。 2 つの磁石シリンダーの間の中央領域

完全に特徴付けられた hUC-MSC は、プトラマレーシア大学医学部病理学部免疫学研究室幹細胞および免疫研究グループから入手しました。臍帯 MSC は、ヒトの臍帯のウォートンゼリーに由来しました。ヒトへその緒は、マレーシアのセランゴール州カジャンにあるブリタニア女性小児病院で、すべての被験者および/またはその法的保護者からインフォームドコンセントを得た後、正期産で得られたものです。ヒト臍帯組織の収集と使用は、マレーシアプトラ大学医学健康科学部の倫理研究委員会によって承認されました。ヒト細胞を使用するすべての方法および手順は、ヘルシンキ宣言を含む関連ガイドラインおよび規制に従って実行されました。細胞は、10% ウシ胎児血清 (FBS)、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、0.5% ファンギゾン、および 0.1% ゲンタマイシンを添加した Dulbecco GLUTAMAX (Gibco、英国) で構成される F12 ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM-F12) で培養しました。ギブコ、英国）。 hUC-MSC に最適化された培地は、Tong et al.63 に記載されているように新たに調製されました。実験計画に基づいて、セルは 3 つにグループ化されました。 i-DE グループは、ガウスメーターで測定した MF の強度 21.6 mT が最も高く均一である永久磁石間の中心に位置しました。 ii-IE グループは DE グループと同じ保育器の上部コンパートメントに配置されましたが、iii-NC グループは MF に曝露されていない別の保育器に配置されました。インキュベーター内の細胞の配置は実験設定に基づいており、図6bに示されています。使用したインキュベーター内のすべての培養条件は 37 °C に維持され、5% CO2 が供給されました。

hUC-MSC を 60 mm シャーレに 1 × 104 細胞で播種し、継代数 6 まで培養しました。位相差 CKX41 倒立顕微鏡 (オリンパス、日本) を使用して細胞の形態を 2 日ごとに観察しました。継代 3 での試験 (DE および IDE) および対照 (NC) グループで得られた画像を記録しました。

増殖速度実験では、継代 3 の 1 × 104 hUC-MSC を 60 mm ペトリ皿に播種しました。各グループについて、2、4、6、8、10、12 日目の 6 つのインキュベーション時点で細胞を異なるペトリ皿に播種しました。各インキュベーション日の成熟時に、TrypLE™ Select Enzyme を使用したトリプシン処理によって細胞を回収しました。（ThermoFisher Scientific、米国）およびトリパンブルー溶液（Sigma-Aldrich、米国）を使用するトリパンブルー排除試験によってカウントされました。データは列挙後に分析されました。同様に、倍加時間分析のために、継代 3 の 1 × 104 hUC-MSC も 60 mm ペトリ皿に播種し、上記と同じ条件下で処理しました。 TrypLE™ Select Enzyme (ThermoFisher Scientific、米国) を使用したトリプシン処理によって細胞を収集し、顕微鏡下で血球計数器によって手動で計数しました。増殖率は生成時間の逆数であり、特定の時間間隔で単位時間当たりに倍加する細胞の数として定義されます。倍加時間はパターソン式によって決定され、平均倍加時間として表されました。

継代 3 の hUC-MSC (2 × 105 細胞) を T-25 組織培養フラスコで培養し、72 時間インキュベートしました。約 80 ～ 90% のコンフルエンスに達した後、細胞を回収して計数し、1 × 106 個の細胞を蛍光活性化細胞選別 (FACS) チューブに移しました。次いで、細胞を冷１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、表１に記載のとおり、細胞１０５個あたり１．５μＬのパネルＭＳＣ抗ヒトモノクローナル抗体で染色した。染色された細胞を２℃で少なくとも１５分間インキュベートした。 –8℃。その後、細胞を洗浄し、５００μＬのＰＢＳに再懸濁し、ＢＤＬＳＲＦＯＲＴＥＳＳＡフローサイトメーター（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）を使用して１０４個の抗体標識細胞を取得することによって細胞表面マーカーを検出した。未染色の蛍光色素結合非特異的アイソタイプ標識細胞を、ネガティブゲーティングを設定するためのすべての測定と並行して対照として使用しました。得られたデータは、製造元 (Becton Dickinson CellQuest ソフトウェア、米国) が提供する Cell Quest Pro ソフトウェアを使用して分析しました。

継代 3 の hUC-MSC を、StemPro 骨形成分化キット (Gibco、Invitrogen、米国) を使用して、中胚葉潜在性評価の一部として骨形成分化能力についてテストしました。 DE グループの場合、10,000 個の hUC-MSC 細胞を完全 MSC 培地を補充した T-25 フラスコに播種し、コンフルエンス細胞の単層に達するまで 37 °C、5% CO2 条件でインキュベートしました。コンフルエントに達したら、さらに 21 日間、細胞培養培地を 3 日ごとに骨形成分化培地と交換しました。対照群の場合、細胞は研究全体を通じて完全MSC培地のみで維持されました。 21 日目の終わりに細胞を回収し、70% エタノールで 60 分間固定しました。続いてアリザリンレッド溶液で 30 分間染色します。すべての細胞培養物を位相差 CKX41 倒立顕微鏡 (オリンパス、日本) で観察し、画像をキャプチャしました。

hUC-MSC を 6 ウェルプレートに 1 ウェルあたり 5 × 104 細胞の数で播種しました。細胞を 3 つの異なる時点 (18、24、および 30 時間) にグループ化し、それに応じてインキュベートしました。各インキュベーション期間の後、細胞を回収し、冷PBSで洗浄し、70%エタノールで-20℃で一晩固定しました。次に、固定細胞を 2 回洗浄し、25 μL の 10 mg/mL RNase (Sigma-Aldrich、米国) に懸濁し、1 mg/mL ヨウ化プロピジウム (PI) 染色 (Molecular Probe、Invitrogen) からなる染色バッファー 500 μL とともにインキュベートしました。室温で30分間インキュベートした。細胞のＤＮＡ分布は、ＢＤＬＳＲＦＯＲＴＥＳＳＡフローサイトメーター（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）を使用して１０４個のＰＩ標識細胞を取得することによって分析した。取得したデータの分析は、ModFit LT ソフトウェア (Verify Software House、米国) を使用して実行されました。

RNA を取り扱う際のすべての標準予防措置は、汚染を避けるために考慮されました。細胞ペレットからの全RNAを、RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germany)を用いて製造業者のプロトコールに従って抽出した。抽出した RNA を RNase-free 水で 13,000 rpm で 1 分間遠心分離して 50 μl に溶出しました。 RNA 濃度と純度は、Nano-Drop ND-1000 分光光度計 (Thermo Fisher Scientific Inc.、米国) を使用して測定しました。 RNA (500 ng) を 1.5% アガロースゲル (Sigma Sigma-Aldrich, USA) のウェルにロードし、90 V で 60 分間電気泳動しました。精製された RNA の完全性は、28S および 18S リボソーム RNA バンドの視覚化によって評価されました。ｃＤＮＡは、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を製造業者のプロトコールに従って使用して生成した。 1 マイクログラム (1 μg) の精製 RNA を使用して cDNA を生成しました。合成された cDNA は -20 °C で保存され、その後の RT-PCR は標準的な 40 サイクルプロトコールを使用して実行されました。基本的に、94℃で10分間の初期変性の後、40サイクル（94℃で45秒間の変性、58℃で30秒間のアニーリング、72℃で90秒間の伸長）、続いて72℃で最終伸長を行う。 ℃で5分間。 RT-PCR アンプリコンを 2% アガロースゲル (SeaKem® LE Agarose、スイス、ロンザ) で分離し、臭化エチジウムで染色しました。ゲルは、Syngene Gel Documentation (Syngene、米国) を使用して視覚化されました。プライマー GADPH、REX 1、SOX2 OCT4、および NANOG の設計は、表 2 に示すように以前の研究から採用されました。RT-PCR 産物アガロースゲル電気泳動から得られた目的の遺伝子のバンド強度は、画像を使用して定量されました。 J™ ソフトウェアは、参照遺伝子 (GADPH) に対して正規化され、以下の式を使用して NC グループに対する倍率変化として表示されます。

GraphPad Prism (バージョン 7) を使用した Student の t 検定によって、hUC-MSC の異なる播種における処理細胞と対照細胞から得られた結果と、有意水準は p 値 < 0.05 に設定されました。

パーセンテージ

プラスマイナス

摂氏

トリチウム化チミジン

骨髄間葉系幹細胞

相補的デオキシリボ核酸

二酸化炭素

1分あたりのカウント

指定のクラスター

直流

直接暴露

ダルベッコ改良イーグルミディアム

デオキシリボ核酸

ウマ成体幹細胞

極度の低周波

極低周波磁場

グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ

ゲガヘルツ

蛍光活性化セルソーティング

食品と医薬品

静止段階

ギャップフェーズ

セカンドギャップ

ヒトウシ血清

ヒト胎児肺線維芽細胞

ヒト白血球抗原

ヒト臍帯由来間葉系幹細胞

ヘルツ

国際細胞治療学会

間接曝露

キロボルト

有糸分裂

メーター

磁場

ミリグラム

主要な組織適合性複合体

マグネト流体力学

ミリメートル

磁気共鳴画像

ミリテスラ

メガワット

Pron.nanOg

ネガティブコントロール

ネオジムフェルムボロン

ナノグラム

オクタマー結合転写因子-4

リン酸緩衝生理食塩水

人口倍増時間

パルス電磁場

ヨウ化プロピジウム

無線電動非対称コンベヤ

リボ核酸

リボヌクレアーゼ

逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応

毎分回転数

合成フェーズ

超電導

標準偏差

サマリウムコバルト

SRY (性決定領域 Y) - ボックス 2

超電導磁気エネルギー貯蔵

静磁場

時間

時間を2倍にする

テスラ

トランスフォーミング成長因子ベータ

組織因子

映像表示端末

マイクログラム

マイクロカリー

マイクロリットル

マイクロテスラ

ジンクフィンガータンパク質 42 ホモログ

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リファレンスをダウンロードする

この研究は、基礎研究助成制度 (FRGS) FRGS/2/2013/SKK01/UPNM/02/1, 0713 助成金によって支援されました。著者らは、この重要な研究を実行可能かつ効果的にするために承認された基金に対してマレーシア高等教育省 (MOHE) に全面的に感謝します。サンプルを収集し、幹細胞研究室の機器を使用し、専門知識を提供してくださったマレーシアのプトラマレーシア大学、セルダン大学医学健康科学部病理学部門、免疫学研究室、幹細胞＆免疫研究グループに多大な感謝を申し上げます。また、資料提供のアシスタントとしてマレーシア国防大学の図書館員に感謝したいと思います。

この研究は、基礎研究助成制度 (FRGS) 助成金 FRGS/2/2013/SKK01/UPNM/02/1, 0713 を通じて、マレーシア高等教育省 (MOHE) から資金提供を受けました。

バイオ人工臓器および再生医療ユニット、マレーシア国防大学、スンガイベシキャンプ、57000、クアラルンプール、マレーシア

ハスリンダ・アブドゥル・ハミド & アジジ・ミスコン

幹細胞および免疫研究グループ、免疫学研究室、病理学、プトラ大学大学、医学健康科学部、43400、セルダン、マレーシア

ラジェシュ・ラマサミー

トゥン・フセイン・オン・マレーシア大学応用科学工学部物理学科、パゴキャンパス、KM1、ジャラン・パンコール、パゴ高等教育ハブ、84600、ムアル、ジョホール州、マレーシア

モフド・カマルルザキ・ムスタファ

イラン医科大学、テヘラン、イラン医科学先端技術学部再生医療研究所

ヴァヒド・ホセインプール・サルマディ

イラン医科大学、細胞分子研究センター、テヘラン、イラン

ヴァヒド・ホセインプール・サルマディ

アイルランガ大学歯学部歯科放射線科、スラバヤ、60132、インドネシア

ラジェシュ・ラマサミー

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HAHは実験の実施、データの分析、論文検索を実施しました。 HAH は AM、RR、VHS、MKMAM の支援を受けて原稿を起草、執筆、更新し、MKM がシステムの SmCo5 静的磁石を製造しました。 AM、RR、VHS、MKM がプロジェクトの監督に協力します。 AM が最初のアイデアを思いつきました。

アジジ・ミスコンへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Hamid, HA、Ramasamy, R.、Mustafa, MK et al. サマリウムコバルト (SmCO5) を使用した磁気曝露により、ヒト臍帯間葉系幹細胞 (hUC-MSC) の増殖と幹細胞性が増加しました。 Sci Rep 12、8904 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-12653-z

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受信日: 2021 年 11 月 16 日

受理日: 2022 年 5 月 11 日

公開日: 2022 年 5 月 26 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-12653-z

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